浙师大化材学院钱兆生课题组联合生命学院张可伟、饶玉春课题组成功研发植物细胞质膜的4D高特异性荧光成像工具

近日，浙江师范大学化学与材料科学学院钱兆生教授课题组联合生命科学学院张可伟教授课题组和饶玉春教授课题组在国际顶级综合性化学期刊 Chemical Science 上在线发表论文“Long-term Spatiotemporal and Highly Specific Imaging of Plasma Membrane of Diverse Plant Cells Using a Near-Infrared AIE Probe”。Chemical Science 是英国皇家化学会(RSC)的旗舰期刊，最新影响因子9.9，SCI分区属化学类一区。

细胞膜（又称质膜）作为保护细胞内环境的屏障，在细胞迁移、细胞增殖、胞吞、胞吐、信号传导和细胞凋亡等生物学事件中起着重要的作用。细胞膜的形态直接反映细胞的生理状态；例如，细胞膜破裂是药物诱导细胞凋亡的重要证据。因此，对细胞膜进行长时间的特异性成像和实时跟踪对于研究细胞生物学、药理学和毒理学具有重要的意义和价值，是生命科学领域常用的工具之一，因而相应荧光探针的开发具有巨大的市场前景。尽管以DIO为代表的第一代细胞膜探针已经市场化，但是这些荧光探针只能在很短时间内特异染色细胞膜，在半小时染色时间内就会将整个细胞染色，无法为观察细胞膜相关的生理过程提供足够的时间窗口。目前，美国Biotium公司和赛默飞公司分别针对这一问题开发了可以进行较长时间域的细胞膜成像探针CellBrite系列和CellMask系列，但是仍然无法实现数小时级别的高特异性成像。相比于动物细胞膜，由于植物细胞壁的存在使得针对植物细胞膜的荧光探针设计更为复杂，因此开发用于植物细胞质膜的长时间精准成像及长期示踪的成像工具仍然面临着巨大的挑战。

最近，钱兆生教授课题组基于前期研究工作提出了“多协同”的设计策略，合理精准地设计出了可用于植物细胞质膜“高特异性”“超长时间成像”的近红外探针，并联合生命科学学院张可伟教授课题组和饶玉春教授课题组在模式植物拟南芥和代表性植物水稻、烟草和洋葱以及其根叶等各类细胞中进行了系统性能研究，证实了该荧光探针可以实现在各种植物各类活细胞的三维高清成像、长达10小时的超长时间成像和高特异性成像，将目前的三维成像功能推进到时间域的四维跟踪成像，为细胞研究提供了一个全新的基于时间域成像工具。

精准设计实现卓越功能

设计用于植物细胞质膜成像的探针分子必须面对穿透细胞壁、提高水溶性以及提高膜保留能力等诸多复杂的问题。因此钱兆生教授团队从细胞膜结构入手，提出了“相似相亲作用、静电相互作用以及抗渗透作用”的多协同设计策略，引入了合适长度的亲脂性单元以保证探针分子的细胞壁穿透能力和质膜锚定能力；引入吡啶基单元修饰分子骨架以保证探针分子质膜结合能力；引入大的空间位阻基团以保证探针分子的膜保留能力。将精准的设计发挥到实际生物应用，最终实现了探针分子的卓越功能。

探针分子APMem-1的设计原理示意图

“4D”高特异性璀璨成像

在实际生物成像应用过程中，随着研究的不断深入，对细胞成像的完整度和跟踪能力也提出了更高的要求。在此研究中，钱兆生教授团队联合张可伟教授课题组和饶玉春教授课题组从“时间”“三维空间”方面对探针分子APMem-1的成像能力进行了验证。实验结果表明，通过合理的设计策略，APMem-1可实现长达10小时的超长时间质膜成像，并在10小时内无明显的细胞信号内化，这也是目前同类商品化质膜染料所无法实现的。除此之外，通过共聚焦显微镜“三维”空间成像证明，通过低剂量、短时间的便捷操作，所有细胞的细胞膜均被明显的亮红色信号染色，且信号由中心向表面逐渐增强，根尖所有细胞的质膜均可被清晰染色。长达10小时的质膜成像效果，与目前美国Biotium公司和赛默飞公司的细胞膜成像探针CellBrite系列和CellMask系列相比，APMem系列探针表现出更加清晰和更为长久的成像性能。

APMem-1染色拟南芥幼苗根尖在561 nm激发下逐层光学扫描构建的三维空间共聚焦图像及高分辨率图像定量分析结果

“化学手段”开发，助力植物细胞成像实现物种普适性

目前开发的细胞质膜成像探针分子只能在很短的时间内实现动物/人细胞质膜的特异性染色，几乎没有开发出针对植物细胞质膜的长期成像的荧光探针。在此钱兆生教授团队开发的APMem-1探针首次实现了小分子有机荧光探针在植物细胞质膜长时间示踪的应用，并通过实验验证了其生物适用性及植物物种普适性。APMem-1可应用于包括洋葱、拟南芥、烟草和水稻在内的多种植物物种，并在半透明的烟草叶片细胞质膜成像中也展示出了令人满意的成像效果。

APMem-1实现超长“时空”细胞质膜成像，其广泛适用于特异性染色不同类型的植物细胞以及不同的植物物种

该研究的最大意义在于，通过合理且精准的设计策略，以价格低廉的成本制备了性能优异的植物质膜探针分子，并且具有超快染色、免洗、低毒以及良好的生物相容性等多方面优势，为长时间连续监测与质膜相关的生理过程提供了有力工具。该部分研究成果正在申请国家发明专利。前期相关科研成果已经在分析领域权威刊物Analytical Chemistry发表一篇论文(DOI: 10.1021/acs.analchem.1c05345)，授权国家发明专利一项 (ZL202111185243.3)。目前，钱兆生教授课题基于该相关成果正在开展产品研发，有望在年内研发完成细胞膜荧光探针产品APMem系列，并且也正在与国内阿拉丁试剂等公司展开积极推介，希望与相关国内生物科技公司合作共同研发，尽快在该领域实现进口替代。

该项目得到了国家自然科学基金(21775139、21675143)以及浙江省杰出青年基金资助项目(LR18B050001)的支持。浙江师范大学为该论文唯一完成单位和通讯单位。浙江师范大学化学与材料科学学院2022级博士研究生左佳琦以及生命科学学院朱恩高博士为论文共同第一作者，钱兆生教授以及张可伟教授为共同通讯作者，饶玉春教授课题组为本研究相关工作提供了大力支持。（浙江师范大学）